超微弱发光检测系统的搭建及其在中药药性判别中的应用
中药药性的客观化判别和评价是制约中药现代化发展的关键问题之一，也是中医药研究的难点和热点。中药药性是药物与治疗相关的性质和效能，它用极其精炼的语言表述一味药或者一类药的临床效用，概括临床效用的范围、属性和特征，是沟通理论和临床实践的桥梁和纽带。但是传统中药药性理论在其形成、发展和应用的过程中，由于受当时对自然界的认识水平所限，对药性的认知主要来源于经验的积累，表述存在模糊性和主观性，这使中药在临床应用过程中缺少可供参考的客观化、定量化的指标，影响中药的安全性和有效性。如何揭示中药药性的科学内涵，实现中药药性的定量化和客观化，成为中药研究亟待解决的问题。<br> 中药材所含物质成分复杂，要把中药药性研究建立在药效清晰的每个化学成分的基础上是相当困难的，这就需要在尚不清楚全体化学成分的情况下，实现对整体的评价，而目前的理化鉴定很难实现，要想取得质的突破则必须另寻它路。超微弱发光(Ultra Weak Luminescence，UWL)是自然界一个普遍的生命现象，广泛存在于动物、植物及微生物等各种生物系统之中，是生物体固有的一种功能。超微弱发光来源于生物分子从高能态到低能态的跃迁，对生物系统外界环境影响和内部变化有高度的敏感性，并与生物系统的光合作用、氧化代谢、信息传递、细胞的增殖、分化与凋亡等重要生命活动关系密切，因此通过对超微弱发光的探测和分析能够获得生物系统内部的整体信息。超微弱发光强度极其微弱，超微弱发光检测系统的搭建可以为超微弱发光检测提供实验条件，该系统具有无侵入性、灵敏度高、快速、可靠的优点，能够为生物系统提供一个反映整体信息的综合指标。超微弱发光是从整体上反映生物系统内部信息，且生物光子探测系统在探测的过程中对样本无任何破坏，保证了样本的原有性质不变。目前超微弱发光已经在植物种子、肿瘤细胞的分类和鉴别中展开了广泛的研究，但是在中药材的分类鉴别，尤其是中药药性的鉴别中尚未见相关报道。本文拟通过建立超微弱发光检测系统，来探索一种能够真正反映中药药性的评价新方法和新模式，这对于揭示中药药性的科学内涵，实现中药药性的定量化和客观化，具有重大意义。<br> 主要研究内容:<br> 第一部分 超微弱发光检测系统的搭建<br> 超微弱发光强度极其微弱，用一般的检测方法很难检测到，所以必须采用灵敏度高和背景噪声低的光电探测仪器才能进行有效的探测。课题组在充分借鉴其它仪器系统和公司开发的相关类似检测系统的基础上，结合本课题的研究特点，联合荷兰Meluna R.V公司共同研发搭建了超微弱发光检测系统。<br> 搭建的超微弱发光检测系统采用高灵敏度的端窗性光电倍增管，增加了探测表面积，提高了探测效率。设计上模块化和自动化的特点为仪器系统的维护和使用提供了便利，减少了人为干扰对实验结果的影响。系统的暗室设计既有利于样品的放置和检测，通过开关的特殊设计减少了外界光线的影响。对系统整体进行电磁屏蔽设计，外部电源采用专业滤波器电源，减少外部电磁信号及电流波动对超微弱发光检测系统的干扰。滤光片系统采用高透光率长通滤光片，其由于磷光现象导致的背景噪声除GG395达77CPS和GG455达22CPS以外，其余滤光片均低于15CPS，相较于样品光强可忽略不计，同时滤光片系统为中药材延迟发光光谱分布检测提供了技术支持。<br> 最终通过实验验证，在光电倍增管制冷至零下22-25℃的条件下，本课题搭建的超微弱发光检测系统在“Background”模式下的背景噪声为10CPS左右;在“SE measurement”模式下的背景噪声在15CPS左右，其仪器的高信噪比为干燥中药材的超微弱发光检测提供了条件。<br> 第二部 分延迟发光与中药药性的相关性<br> 第一，基于搭建的超微弱发光检测系统，探讨干燥中药材粉末延迟发光的影响因素，优化实验条件，建立中药材延迟发光实验技术体系。实验发现不同的激发光源，样品的含水量，样品的颗粒大小对延迟发光有着明显的影响。为了使后续实验结果具有可比性，我们将实验条件确定为:室温22℃，RH50％;光电倍增管制冷时间2小时，制冷最低恒定温度为零下20-23℃;盛放中药样品的平皿直径5cm，5g中药样品平铺在平皿底部;激发光源为白光，激发时间为10s;样品颗粒大小用中药筛筛选80-120目大小颗粒;样品含水量控制方式为干燥器中连续干燥16h;计数间隔时间为1s，计数量为200个，连续重复测量3次。<br> 第二，选取《中国药典》2010版中根类及根茎类中药，基于搭建的超微弱发光检测系统，检测中药材粉末样品，获取不同中药药性样品的延迟发光动力学曲线，结合双曲线数学模型及统计熵数学模型，推导平均光子数和相干时间数学模型，通过数据拟合分析，获得表征延迟发光动力学曲线的的参数，其中I0反映的是延迟发光的初始强度，其与样品本身的性质相关;β是一个指数因子，它与曲线弛豫衰减的速率相关;τ是一个特征时间，与样品的性质相关;N表示的平均光子数;T表示的是特征时间;S是统计熵样品的整体有序性相关。<br> 第三，基于获得的中药样品延迟发光动力学参数，通过聚类分析将选取的中药分组，通过比较聚类分析分组与中药药性药效之间的关系，发现延迟发光参数的聚类分析结果与基于《中国药典》2010版的中药寒热药性存在较高一致性，验证延迟发光可能与中药寒热药性存在相关性。<br> 第三部分 不同药性中药材的光谱分析<br> 第一在本章中，我们利用光谱仪检测所采用滤光片的技术性能。实验结果显示所有滤光片的光透过率均在88％-90％之间，具有较高的透光率，可用于超微弱发光的检测。<br> 第二在上一章节优化的实验条件下，利用搭建的超微弱发光检测系统及长通滤光片系统对中药材延迟发光的光谱分布进行检测，对数据进行衰减概率分布整理分析，结果显示不同寒热药性分组的中药材的延迟发光衰减概率分布函数的Pmax和γmax存在显著性差异。<br> 第三通过对不同寒热药性分组的中药材的光谱分布比值的分析，我们也发现在小于610nm范围内的光谱分布比值中，寒性中药组高于热性中药组，而大于610nm光谱范围的光谱分布比值中，热性中药组高于寒性中药组。从光谱分布的角度验证了寒热药性中药的客观差异。<br> 第四部分 基于延迟发光的中药寒热药性判别方法<br> 第一在前期研究的基础上，选取153种寒热药性的中药材作为研究对象，按照随机原则分为实验组和验证组。首先对实验组检测其延迟发光动力学曲线，通过数据拟合及计算分析，获得反映延迟发光曲线性质的参数分别为初始强度I0、衰减指数β、特征时间τ、平均光子数N、衰减时间T和统计熵S。随后通过Pearson相关系数分析这6个参数的相关性，将研究参数筛选为平均光子数N、衰减时间T和统计熵S。利用实验组筛选后的参数对进行Logistic回归分析，最终结果显示平均光子数N和统计熵S与中药药性的判别存在相关性，可以作为探讨中药药性的判别指标，并形成判别公式Y=1/1+e(-11.981+2.892*X1+0.270*X2)，（X1=统计熵S，X2=平均光子数N），其寒性中药材的判别准确率为83.1％，热性中药材的判别准确率为75.6％，整体的判别准确率为79.4％，整体判别的准确性较高。<br> 第二进一步对训练组利用ROC曲线分析对判别参数的判别效果进行评价，实验结果显示，通过logistic回归分析获得的参数统计熵S、平均光子数N，判别公式获得的整体参数Y的判别的准确率分别为83.93％、80.36％、78.57％，判别参数的临界阈值分别为3.95、3442.39、0.7914，具有较高的准确性，可作为客观化的中药寒热药性判别指标。<br> 第五部分 结论及创新点<br> 一、结论<br> 1.验证了中药寒热药性与中药延迟发光之间存在相关性;证实延迟发光技术可以作为反映中药药性基本特征的综合指标;建立了中药材延迟发光检测实验技术体系。<br> 2.建立基于中药材延迟发光动力学参数的中药寒热药性判别公式，为中药药性的客观评价提供了统计墒S、平均光子数N两个判别指标和判别数学模型，获得判别临界阈值为3.95、3442.39、0.7914，判别的准确率分别为83.93％、80.36％、78.57％。<br> 一、创新点和不足<br> 1.首次运用既符合现代科技认知的技术方法又与中医药基础理论整体观相自恰的延迟发光技术探讨中药药性，验证了中药材延迟发光与中药寒热药性之间存在相关性。但是由于缺少临床研究，不能揭示中药药性的作用机制。<br> 2.初步建立基于中药材延迟发光的中药寒热药性客观化的评价方法，为中药药性的客观评价提供了统计墒S、平均光子数N，综合判别值Y三个判别指标，期判别临界阈值为3.95、3442.39、0.7914，判别的准确率分别为83.93％、80.36％、78.57％。但是延迟发光是从整体上判断中药药性，目前不能够进一步对药性更细致分类。